Fundamentos de Enzimología

Docentes:

Dr. Ricardo Román Madoery.

Dra. Mariana Cecilia Minchiotti.

Docente coordinador: Dr. Ricardo Román Madoery

Objetivo General:

Abordar el estudio de las enzimas desde un enfoque cinetista

Objetivos Específicos:

Reconocer la importancia de la cinética enzimática como herramienta para la descripción cuantitativa de la biocatálisis.

Formar en el diseño y evaluación de ensayos enzimáticos

Capacitar en la selección de metodologías para la purificación de enzimas

 

Contenidos:

Módulo I (8 hs)

 

Introducción al estudio de las enzimas: qué son y para qué estudiarlas. Generalidades sobre estructura de proteínas, clasificación de enzimas y rol en la naturaleza. La química orgánica de las reacciones catalizadas por enzimas. Bases moleculares de la biocatálisis. La cinética y la termodinámica de una reacción química. Cómo encarar el estudio de las enzimas ?: el enfoque estructuralista y el enfoque cinetista.

El ensayo enzimático: la determinación de la velocidad de reacción. Actividad enzimática específica. Factores que influyen en la actividad de una enzima. Principios del ensayo enzimático y los estudios cinéticos. Criterios en la selección de las condiciones experimentales: el diseño experimental. Metodologías para determinar la actividad enzimática. Métodos electroquímicos: pH-stat. Métodos espectrofotométricos. Otros métodos.

Módulo II (8 hs)

Extracción y purificación de enzimas. Estrategias metodológicas en función de su localización en el medio biológico. Métodos alternativos: avances en el aislamiento de enzimas secretorias vegetales por extracción selectiva desde el apoplasto. Purificación primaria. Concentración del extracto. Métodos cromatográficos generales y específicos. Separación en base a estructura molecular (carga, hidrofobicidad). Separación en base a tamaño molecular. Cromatografía de afinidad e inmuno-afinidad.. Criterios de pureza de una preparación enzimática: actividad enzimática específica y electroforesis SDS-PAGE. Representación del avance de la purificación: rendimiento y factor de purificación. Caracterización bioquímica.

Módulo III (8 hs)

Cinética enzimática en sistemas unirreactante: reacciones de primer orden y pseudo primer orden. El concepto de velocidad inicial. El complejo enzima-sustrato. Teoría de Henri-Michaelis-Menten del equilibrio rápido. Teoría de Briggs-Haldane del estado estacionario. La derivación de la ecuación de velocidad. Los parámetros cinéticos: constante de Michaelis y Velocidad máxima. Macro y micro constantes cinéticas. Determinación gráfica. Procesamiento de datos obtenidos en los ensayos de cinética enzimática. Activación e inhibición de reacciones enzimáticas. Efectos alostéricos. La ecuación de velocidad como vínculo entre el experimento cinético y el mecanismo en la reacción enzimática (modelo).

Los parámetros cinéticos y la eficiencia catalítica: importancia en la investigación bioquímica y en la aplicación tecnológica de las enzimas.

Módulo IV (8 hs)

Procesamiento computacional de datos de cinética enzimática (programas). La cinética enzimática en sistemas complejos. Derivación de la ecuación de velocidad en sistemas multirreactante. Limitaciones de la investigación cinética en condiciones de velocidad inicial. La importancia del estudio de la extensión de la reacción. Utilización de herramientas computacionales específicas para la construcción y evaluación de modelos cinéticos de reacciones catalizadas por enzimas.

Enzimología interfacial: el estudio de enzimas que actúan a nivel de interfaces. Fosfolipasa A2, el paradigma de enzima interfacial. Los fosfolípidos y su capacidad de autoorganización: formación de estructuras supramoleculares. Cinética enzimática interfacial: los parámetros cinéticos aparentes. Implicancias biológicas y tecnológicas.

Módulo Integración-Consultas

 

Bibliografía:

  • Berg, O., Jain, M.  Interfacial Enzyme Kinetics. Wiley & Sons Chichester, UK.
  • Berg, J., Tymoczko, J., Stryer, L.  Bioquímica. Ed. Reverté Barcelona, España.
  • Cornish-Bowden, A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. Portland Press London, UK.
  • Eisenthal, R., Danson, M. Enzyme Assays. A practical Approach. IRL Press Oxford, UK.
  • Harris, E., Angal, S. Protein Purification Methods. IRL Press Oxford, UK.
  • Segel, I. Enzyme Kinetics. Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady.State Enzyme Systems. Wiley & Sons New York, USA.

 

Material de estudio:

Presentación Power Point y material complementario de cada módulo, en formato digital o impreso.

 

Fechas de clases:  

  • 2, 7, 10, 14, 16, 21, 24 y 29 de Noviembre 5 y 12 (Evaluación) de Diciembre del 2016.

Modalidad: Presencial. Clases expositivas sobre aspectos teóricos y prácticos.

Tipo Evaluación: Examen final

Horas totales: 40 hs (otorga 2 créditos)

Arancel: A disponer por HCD para el año académico 2016. 

Horario: 9 a 13 hs. 

Destinatarios: Dirigido a graduados universitarios de carreras de ciencias agropecuarias, ciencias biológicas, ciencias médicas y ciencias químicas.

Cupo mínimo y máximo: mínimo 8 alumnos, máximo 20 alumnos.